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    RayBiotech抗體芯片在乳頭狀甲狀腺癌惡化機制研究的應用

    發布日期:2018-05-23

    雜志名稱:Cell Death and Disease


    文獻題目:Yu, Shi-Tong, et al. "CRLF1 promotes malignant phenotypes of papillary thyroid carcinoma by activating the MAPK/ERK and PI3K/AKT pathways." Cell death & disease 9.3 (2018): 371.


    第一作者:Shi-Tong Yu


    通訊作者:Mu-Sheng Zeng、Xiao-Ming Huang

    作者單位:Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, 107 Yanjiang West Road, Guangzhou, 510120, China


    本實驗所用產品:AAH-MAPK-1(人MAPK磷酸化信號通路芯片)


    實驗樣品:乳頭狀甲狀腺癌組織

    研究背景:

        乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是最普遍的內分泌癌癥,是甲狀腺癌近十年中發病率最高的類型。PTC通??杀恢斡?,5年生存率>95%,但在某些病例中,PTC去分化且伴有侵略性。近期研究表明,遺傳學變化可通過MAPK/ERK和PI3K/AKT通路促進腫瘤增殖和轉移,導致不良預后。對不良預后患者表達的基因進行基因圖譜分析,發現細胞因子受體樣因子(CRLF1)在癌組織中有較大的變化,可作為PTC治療的潛在靶點。CRLF1是一種分泌蛋白,屬于細胞因子受體家族,雖然已有報道CRLF1能促進神經細胞生長和存活,但對其功能機制尚未明確。本文探究CRLF1在PTC中的表達和其在PTC中的主要功能與分子機制。



    1 結果

    1.1 生物信息學分析說明CRLF1可作為PTC的候選靶點基因

        為區分出PTC中潛在的腫瘤相關基因,生物信息軟件分析TCGA數據,發現了197個候選基因。取PTC組織通過定量逆轉錄PCR(qRT-PCR)驗證,發現CRLF1 mRNA和CRLF1蛋白表達水平明顯偏高。(圖a)對不同細胞系(TPC-1、 IHH-4、 B-CPAP、8305C 、SW579、Nthy-ori 3-1)進行qRT-PCR和免疫印跡(WB),發現CRLF1 mRNA和蛋白只在B-CPAP (PTC細胞系)和 8305C (甲狀腺未分化癌) 表達(圖d)。表明CRLF1高表達于PTC,尤其是那些伴有淋巴結轉移或癌癥晚期的患者中。

     

    1.2 CRLF1高表達與侵略性臨床病理特征和低生存率有關

         為了進一步研究CRLF1表達量和癌癥臨床病理特征的相關性,免疫組化分析201份PTC切片樣本。結果表明,有83個樣本(41.3%)高表達CRLF1,高表達CRLF1與腫瘤大小、甲狀腺外擴散、T期、N期和臨床期有關(表1)。將病患分為兩個組(I/II期和 III/IV期),發現高表達CRLF1的患者樣品伴有較差的疾病生存率(DFS)(圖d/e)結果說明,CRLF1表達水平與低生存率有關,CRLF1蛋白表達量對PTC有重要的預后作用。

     

    1.3 CRLF1促進PTC細胞增殖

          通過對CRLF1基因進行功能獲得型(突變)和功能缺失型(突變)實驗,探究CRLF1的作用。B-CPAP細胞中CRLF1經siRNAs (si-1#和si-2#)處理后被抑制,B-CPAP細胞增殖速率和克隆形成能力低于對照組(si-NC)。將超表達的CRLF1的TPC-1細胞系(低表達CRLF1)中,發現CRLF1異常表達增強細胞增殖能力(圖f/g)。評估CRLF1對體內腫瘤生長的作用效果, CRLF1超表達的IHH-4 細胞,細胞生長更快且面積更大(圖h)。結果說明CRLF1促進腫瘤體外和體內增殖。

                       

     

    1.4 CRLF1促進PTC細胞遷移和侵入并誘導上皮間質轉化

        由于CRLF1表達水平與N期和M期有關,我們進一步研究CRLF1是否影響B-CPAP 細胞遷移能力和侵入能力,結果轉染si-CRLF1-1#或 si-CRLF1-2#的細胞遷移能力明顯低于si-NC組,說明CRLF1提高PTC細胞的遷移能力和侵入能力。TPC-1和IHH-4細胞中CRLF1異常表達能促進遷移和侵入,說明CRLF1能增強PTC細胞的遷移能力和侵入能力(圖c)。實驗研究CRLF1是否影響PTC細胞的上皮間質轉化(EMT),結果鈣粘蛋白表達下調。間葉細胞標記物(波形蛋白、纖粘連蛋白)表達水平上調,證明CRLF1在PTC細胞中誘發EMT(圖f)。CRLF1敲除抑制細胞生長入侵,進一步說明CRLF1可能促進PTC細胞惡性表型。

     

              

     

    1.5 CRLF1通過MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路調控致瘤

            為了確定CRLF1在PTC細胞中影響腫瘤形成的潛在機制,使用磷酸化信號檢測芯片檢測IHH-4細胞。在CRLF1超表達的IHH-4細胞中AKT (p-S473) 和 ERK1/2 (p-T202/Y204, p-Y185/Y187)磷酸化水平升高(圖a)。WB分析,發現CRLF1可能激活JAK2和SHP2磷酸化,從而激活ERK1/2和AKT(pS473)磷酸化。在CRLF1超表達的IHH-4腫瘤細胞中p-ERK1/2和 p-AKT高表達。加入U0126 ( MEK 抑制劑) 和 MK-2206 ( AKT抑制劑),判斷抑制劑是否可以影響IHH-4-CRLF1癌細胞的生長,結果ERK 和 AKT表達水平下調,說明CRLF1可能通過部分MAPK/ERK和 PI3K/AKT信號通路調控腫瘤形成(圖d)。

                     


     

    結論

     

       在本文中,首先驗證了CRLF1可以增強PTC癌細胞的浸潤能力,導致不良預后,緊接著通過磷酸化信號檢測芯片,發現了CRLF1異常表達可能激活JAK2和SHP2磷酸化,接著激活MAPK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路調控腫瘤形成。本研究說明了CRLF1對癌細胞快速生長和克隆的重要作用,為進一步研究PTC有重要意義。

     

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